微滴式數字PCR（ddPCR^?）以其優(yōu)異的靈敏度，準確性和重復性受到全球科研人員喜愛。ddPCR^?經典重溫系列，正是帶您重訪那些奠定技術基石的里程碑研究——2011年發(fā)表在《Analytical Chemistry》雜志的文章，不僅詳細介紹了ddPCR^?技術的原理，工作流程，還將這項當時突破性的技術進行了應用拓展。通過三個實驗案例CNV，稀有突變和絕對定量實驗凸顯了ddPCR^?技術超高的分辨率和靈敏度。

研究通過ddPCR^?技術對7例HapMap樣本的3個目標基因（MRGPRX1、CYP2D6及X染色體）進行拷貝數變異（CNV）分析。實驗采用雙探針體系（目標基因FAM標記/參考基因RPP30 VIC標記），實現單孔同步檢測與內標校準。結果顯示：

1.MRGPRX1基因：單孔檢測即可精準區(qū)分1~6拷貝的連續(xù)變異狀態(tài)（圖a），突破傳統(tǒng)qPCR對多拷貝基因的分辨極限；

2.CYP2D6與X染色體：低拷貝數（1-3）變異亦呈現清晰聚類，證實技術對基因組微缺失/微重復的檢測效能；

3.CCL3L1基因（HIV易感關聯(lián)）：在13例HapMap樣本中，ddPCR^?技術測得NA18507樣本拷貝數為6.05，而NGS僅報告5.7（圖b）。值得注意的是，NGS因全基因組分散覆蓋導致靶基因區(qū)域平均測序深度僅30×，而ddPCR^?技術通過靶向富集策略，單孔即可實現雙基因20,000×檢測通量——這一數量級差異解釋了二者在分辨率上的顯著差距。

這一案例凸顯了ddPCR^?技術在靶向高精度定量中的獨特優(yōu)勢：其通過超高通量分區(qū)（單孔20,000微滴）與統(tǒng)計學模型，將檢測靈敏度提升至單個分子水平，為復雜CNV的臨床研究提供了可擴展的技術平臺。

通過微滴式數字PCR（ddPCR^?方法）確定拷貝數變異狀態(tài)。（a）在HapMap樣本中對MRGPRX1、X染色體、CYP2D6和（b）CCL3L1基因的拷貝數變異狀態(tài)進行測量。（c）在正常和腫瘤乳腺組織中提取的DNA中，GRB7和ERBB2基因拷貝數變化的相關性。每個標記代表來自單個ddPCR^?孔（約20,000個微滴）的拷貝數變異（CNV）測量結果。誤差條表示每個拷貝數測定的泊松95%置信區(qū)間。

通過體系優(yōu)化，實時定量PCR（qPCR）對突變等位基因的檢測下限可達1%。而基于相同TaqMan探針體系，微滴數字PCR（ddPCR^?技術）通過物理分區(qū)策略實現了技術性能的躍升：其將目標突變DNA從高達10^5倍的同源野生型背景中分離，使突變/野生型有效富集倍數提升2萬倍。

理論模型表明，突變分子的富集效率與反應體系的分區(qū)數呈正相關——單個樣本的2萬微滴分區(qū)使每個反應單元的競爭性擴增干擾降至可忽略水平。

以BRAF V600E突變?yōu)槔?，雙探針TaqMan檢測驗證了該技術的超敏特性：在野生型DNA絕對優(yōu)勢（突變頻率0.001%）的極端條件下，ddPCR^?技術仍能穩(wěn)定檢出突變信號，靈敏度較qPCR提升三個數量級。

值得注意的是，該技術可通過增加樣本投入量（經限制性酶切預處理降低粘度）進一步突破檢測極限，為臨床痕量樣本（如循環(huán)腫瘤DNA、胎兒游離DNA）分析提供解決方案。

此項突破性進展標志著分子診斷進入"萬分之一"靈敏度時代：研究者得以在單堿基分辨率下解析<0.01%的稀有突變，為微小殘留?。∕RD）監(jiān)控、無創(chuàng)產前診斷（NIPT）及腫瘤早篩等場景開辟精準量化新途徑。

通過ddPCR^?系統(tǒng)檢測在同源野生型DNA背景下BRAF V600E稀有突變等位基因。將突變細胞系DNA進行系列稀釋，置于恒定的野生型人類基因組DNA背景中。微滴分區(qū)減少了競爭性擴增效應，使得檢測限可低至0.001%的突變比例，比實時定量PCR（qPCR）提高了1000倍。該突變細胞系中BRAF V600E的含量為35%，由ddPCR^?技術測量得出。

通過ddPCR^?技術對19例孕10-20周孕婦血漿中的胎兒游離DNA進行絕對定量。針對cfDNA片段化、低豐度的特性，采用雙策略檢測體系：基于SRY基因標記男性胎兒DNA，同時利用甲基化酶切（HhaI/HpaII）選擇性保留胎兒高甲基化RASSF1基因，結合管家基因（β-actin）實現總DNA定量。

結果顯示，胎兒DNA占比（胎兒負荷）為2.1%-11.9%，其中男性樣本的甲基化RASSF1與SRY定量結果高度相關（R2=0.937），驗證了女性胎兒檢測的可靠性。相較于NGS技術（全基因組平均深度30×），微滴式數字PCR通過單孔2萬次檢測事件實現靶向超高靈敏度，在CCL3L1基因拷貝數分析中分辨率優(yōu)于NGS（6.05 vs. 5.7拷貝）。該技術突破性別依賴限制，為無創(chuàng)產前診斷提供普適性解決方案，并推動液體活檢向更早孕周及腫瘤早篩領域拓展。

對男性和女性胎兒的無細胞血漿中循環(huán)胎兒和母體DNA的絕對定量。

(a) 使用SRY（紅色條）和高甲基化RASSF1（藍色條）定量胎兒DNA濃度。胎兒DNA的RASSF1基因高甲基化，而母體DNA低甲基化。通過甲基化敏感限制酶選擇性消化低甲基化部分，保留高甲基化的胎兒DNA用于定量。

(b) 總DNA濃度（黑色條）為六次獨立檢測的加權平均值，包括未消化的RASSF1、β-肌動蛋白、RNaseP和TERT。

(c) 胎兒負荷通過SRY/總DNA（僅男性胎兒）和RASSF1/總DNA（男性和女性胎兒）比值計算。男性胎兒中，SRY與RASSF1胎兒負荷的相關系數為97.3%。由于胎兒DNA并非完全高甲基化，部分樣本的RASSF1胎兒負荷低于SRY測定值。

ddPCR^?技術還有更大的威力，更廣的應用，如何利用微滴式數字PCR的特性挖掘出更多的場景，我們共同努力。

* BIO-RAD 是 BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定區(qū)域的商標。

* 本產品僅用于科研用途，不用于臨床診斷。